Кейли Куоко родилась 30 ноября 1985 года в городе Камарилло, США. Её мать работала декоратором, а отец риелтором. Фамилия Кейли итальянского происхождения, так как её отец выходец из этой страны. Детство Кейли было связано с теннисом, она даже поднялась довольно высоко в молодежных рейтингах, однако в шестнадцать лет забросила этот вид спорта.

В 1995 году состоялся её дебют в кино, она сразу оказалась в компании именитых звезд, её партнерами по фильму «Виртуозность», стали Дензел Вашингтон и Рассел Кроу. После кино дебюта последовали эпизодические роли в сериалах - «Комнаты кошмаров», «Шоу Эллен» и «Меткого броска».

В 2002 году актриса получила приглашение сняться в главной роли молодежного сериала «8 простых правил для друга моей дочери-подростка» в итоге она работала в проекте до 2004 года. После окончания работы над данным проектом, Кейли была в основном задействована в эпизодических ролях, наиболее яркие из которых сериал «Зачарованные», озвучка мультсериала «Шестнадцатилетние», а так же «Побег из тюрьмы».

В 2007 году актриса получила роль, принесшую ей в итоге мировую известность. В сериале «Теория большого взрыва» Кейли сыграла главную героиню Пенни, не слишком умную блондинку, которая после переезда оказалась соседкой двух ботаников ученых. Большую часть времени Кейли уделяла именно этому проекту, однако успела сняться в комедии «Бунт ушастых» и фантастическом фильме «Суррогаты».

Снимаясь в сериала «Теория большого взрыва», Кейли почти два года тайно встречались со своим партнером по проекту Джонни Галэки, об этом стало известно, только после расставания пары, они сохранили приятельские отношения и продолжают успешно работать вместе.