Карьеру в актёрском искусстве Пенелопа начала в 1991 году на телевидении. Её кинодебют состоялся через год, после выхода на широкие экраны комедийной драмы «Ветчина, ветчина», получившей одобрение критиков. В дальнейшем она построила успешную кинокарьеру, снявшись более чем в пятидесяти фильмах, среди которых были «Открой глаза», «Страна холмов и долин», «Девушка твоей мечты», «Женщина сверху», «Кокаин» и «Ванильное небо».

Обладательница премий «Оскар» (первая испанская актриса, получившая награду) и BAFTA, номинантка на «Золотой глобус» за лучшую женскую роль второго плана в фильме «Вики Кристина Барселона». Также работала в фильмах «Возвращение» и «Девять», за которые была номинирована на «Оскар» и «Золотой глобус». Владелица именной звезды на Аллее Славы в Голливуде.

Помимо актёрской карьеры, Крус активно работает в модельном бизнесе — она сотрудничает с такими компаниями, как Mango, Ralph Lauren и L'Oréal. Также занимается филантропией, регулярно жертвуя денежные средства на благотворительные цели странам, и участвует в борьбе со СПИДом.

Пенелопа в дружеских отношениях с испанским режиссёром Педро Альмодоваром. Они знакомы почти двадцать лет и вместе работали в фильмах. Крус также дружит с мексиканской актрисой Сальмой Хайек. В кругу друзей актрису называют Пе.

Три года длился роман между Крус и Томом Крузом, начавшийся после их совместной работы в фильме «Ванильное небо». Об их расставании стало известно в январе 2004 года. В апреле 2003 года она подала иск против австралийского журнала New Idea за клевету в статье об её отношениях с Крузом. После разрыва отношений с Крузом, актриса с 2005 по 2006 год встречалась с Мэттью Макконехи.

В апреле 2007 года Крус рассказала в интервью испанскому журналу Marie Claire, что хотела бы усыновить нескольких детей.

С июля 2010 года Пенелопа замужем за актёром Хавьером Бардемом (род. 1969), с которым она встречалась 3 года до их свадьбы. У супругов есть двое детей — сын Леонардо Энсинас Крус (род. 25 января 2011) и дочь Луна Энсинас Крус (род. 22 июля 2013).